在生物医学研究中，科研人员常常会谈到他们珍贵的RNA样品，这时我们通常会听到“把那根试管放在冰上！！”和“我希望它不会降解”这样的呼喊。RNA的稳定性通常不如大多数分子生物学研究中使用的其他大分子（如DNA或蛋白质）。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）也面临“易碎性”问题。为了解决这个难题，研究发现可以通过化学修饰来增强gRNA的稳定性，同时保持其有效引导Cas9产生目标断裂的功能。这些技术的进展不仅提升了靶向效率，也缓解了对RNA状态的过度担忧。有些gRNA的修饰不仅增加了稳定性，还赋予了颜色变化，甚至改变了其功能开关。

稳定gRNA的修饰通常涉及磷酸糖骨架的改造。CRISPR/Cas9靶向的识别序列由约20个核苷酸的gRNA引导，而这个gRNA是较大的CRISPR RNA（crRNA）的组成部分。除了20个核苷酸的引导序列，crRNA的3'末端还带有约20个核苷酸的重复区。这一重复区域与Cas9蛋白的相互作用是通过转录活化的crRNA（tracrRNA）实现的。然而，这些RNA分子易受细胞质和核酸酶的攻击，因为它们常被识别为外源RNA。为保护RNA不受降解，现有多种简单的方法可用于修饰RNA骨架的糖或磷酸分子，从而提高其稳定性。

自然界早已进化出多种机制来保卫重要的细胞RNA分子，许多科学家感叹这一点。最常见的保护性修饰是2'-O-甲基化，即在核糖的2'羟基上添加甲基，以避免被除核酶攻击。另一种也在同一位置的稳定修饰是2'-氟（2'-F），它用氟代替羟基。此外，3'-硫代磷酸酯键也是一种受欢迎的稳定修饰，其中硫代替了非桥接的磷酸氧。其他有用的骨架修饰还包括酰胺键、解锁核酸和受限的乙基修饰。

那么，哪种RNA骨架修饰表现更佳呢？研究表明，把几种修饰结合在一起，比如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰，往往比单独使用任何一种修饰来得更为稳定。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室内完成，或者在购买gRNA时作为合成修饰进行订购。修饰通常是添加在crRNA分子的末端（通常前3个核苷酸中的1-3个会被修饰），以达到最佳稳定性和效果。

在想要提高gRNA效率的过程中，简单地将几种核糖核苷酸更换成脱氧核苷酸，便是一种有效的策略。部分带有DNA的gRNA表现出惊人的稳定性，并且能够提高靶向效率。同时，锁定的核酸或桥接的核酸也可以被引入gRNA中，这些修饰促进了RNA的构象限制，从而增强了错配鉴别能力，并提高了对核酸酶的抵抗力，减少了脱靶事件。尽管两者的优点相似，N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率略高且毒性更小。

许多gRNA的稳定修饰是在CRISPR/Cas9出现之前就已开发，主要用于siRNA和反义寡核苷酸等应用。特别是一些合成修饰，减少了与gRNA传递相关的先天免疫反应，尤其在因引入外源RNA而影响细胞活力的实验中，这一点显得尤为重要。

随着gRNA修饰技术的发展，科研人员开始利用可光激活和可光切割的gRNA，解决了许多问题。这种技术在gRNA的20nt靶向区域中引入了可光切割的2-硝基苄基接头，使得在适宜的光线下仅需暴露不到一分钟，gRNA便会被裂解，失去功能。此外，这一系统的光激活对应物通过使用被光笼住的gRNA，在短暂的光照后，gRNA会被释放，CRISPR/Cas9系统得以启动靶向编辑事件。这些技术均通过对RNA进行化学修饰，允许使用简单的LED灯来控制整个编辑过程。

在靶向实验中，对gRNA进行染料标记可以让转染效率变得可视化，甚至在细胞实验中追踪其定位。研究人员可以选择合适的染料，或使用试剂盒自行动手，亦或是购买带有标签的商业合成染料。如果需要更深入的标记，crRNA或tracrRNA同样可以进行染料标记。在单个向导系统中（crRNA与tracrRNA合为一个分子），虽然可能不需要此类方案，但仍可以选择适合的染料。

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